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家蚕OCIAD2基因的克隆表达及其定位研究

韩聪

   OCIA(ovarian cancer immuno-reactive antigen)是一类具有跨膜结构的保守蛋白,它们的一个共同特征是含有OCIA超家族结构域。OCIA基因经选择性剪接后会产生多种同源异构体,编码的氨基酸序列稍微有差别。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条编码OCIAD2的cDNA序列(基因登录号为DQ443385),我们将其命名为BmOCIAD2(Bombyx mori ociad protein isoform 2)。该序列的ORF为645 bp,编码214个氨基酸残基,基因组序列比对后发现该序列是由5个外显子,4个内含子剪接而成。将推测的氨基酸序列进行同源性比对,发现该蛋白与其他物种的相关蛋白具有一定的同源性。 扩增BmOCIAD2基因的ORF并克隆到表达载体pET-28a(+)相应酶切位点上,成功构建了重组表达质粒pET-28a(+)-BmOCIAD2,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的基因表达后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,显示重组蛋白成功表达,主要以包涵体的形式存在。用尿素溶解包涵体后以亲和层析的方法纯化重组蛋白His-BmOCIAD2。FPLC反相柱进一步纯化重组蛋白,质谱鉴定测得该重组蛋白的分子量为27437 Da,与理论值相符,进一步证实了该蛋白表达的正确性。用纯化得到的重组蛋白为抗原免疫雄性新西兰白兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA方法检测该抗血清(多克隆抗体)的效价可达到1:12800以上。 利用多克隆抗体进行免疫印迹实验,结果表明BmOCIAD2在家蚕四个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在五龄幼虫的睾丸、马氏管、卵巢、头的表达量较高。利用荧光定量PCR技术对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期以及五龄幼虫各组织中BmOCIAD2的mRNA转录水平进行比较,分析发现在蛹期mRNA含量最高;在五龄幼虫的睾丸、马氏管、卵巢、气管、表皮、肠、头、脂肪体、丝腺中BmOCIAD2的mRNA含量依次减少。用免疫荧光技术对BmOCIAD2进行亚细胞定位研究,结果显示BmOCIAD2主要存在于家蚕卵巢细胞系BmN细胞的细胞膜中。上述这些结果都为我们进一步研究BmOCIAD2的相关功能提供了重要依据。……   
[关键词]:家蚕;BmOCIAD2;表达分析;亚细胞定位
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江理工大学2010年