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家蚕脂蛋白BmLp-c21的研究

杨丹

   脂蛋白即载脂蛋白和脂质结合的复合蛋白,表层含蛋白质(载脂蛋白)和极性脂质(磷脂和未脂化的胆固醇),核心含甘油三酯和胆固醇酯。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条脂蛋白的cDNA序列,其全长为2803 bp,ORF框为792 bp,编码263个氨基酸残基,预测该蛋白的分子量为30.24 kD,等电点为7.23,将其命名为BmLp-c21。根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增目的基因ORF框,插入表达载体pET-28a(+),成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmLp-c21并转化大肠菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后裂解菌体进行SDS-PAGE分析,在34 kD左右的位置有特异性蛋白条带,与预测值(融合His标签3.56 kD,BmLp-c21 30.24 kD)相符,融合蛋白以包涵体的形式存在。将包涵体洗涤,溶解处理后,经Ni-NTA柱亲和层析得到纯化的融合蛋白。用该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价在1:6400以上。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmLp-c21在家蚕不同发育时期、五龄幼虫不同组织中的mRNA的转录水平进行比较。BmLp-c21基因在家蚕四个发育时期中的转录水平由高到低依次为蛹、五龄幼虫、蛾及卵。BmLp-c21基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录由高到低依次为血液、脂肪体、气管、精巢、卵巢、中肠、丝腺、头部、马氏管及表皮。提取家蚕卵、五龄幼虫、蛹和蛾四个时期及五龄幼虫的头部、血液、丝腺等各组织的总蛋白,进行免疫印迹实验,结果显示,BmLp-c21蛋白在家蚕各发育时期均检测到表达信号。BmLp-c21蛋白在家蚕的生殖腺、气管、血液和脂肪体组织中有表达,而在丝腺、中肠、表皮等组织中我们并没有检测到该蛋白的存在。以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,BmLp-c21蛋白主要分布在细胞质中。……   
[关键词]:家蚕;BmLp-c21;Western blotting;RT-PCR;亚细胞定位
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江理工大学2010年