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重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定

朱晓娟

  肝细胞肝癌在我国的发病率较高,且恶性程度高,是严重影响我国人民健康的恶性肿瘤之一。尽管近半个世纪以来我国在肝癌的临床治疗方面积累了丰富的经验,基础研究方面也取得长足的进步,但远未达到控制该肿瘤的程度;肝癌对常规的放疗、化疗方法不敏感,近年来多倾向于以手术为主的综合治疗,但手术治疗仅对部分早期患者适用,且术后一年生存率仅为39.7%,因此亟需利用现代生物技术探索新的治疗方法。 抗体技术及融合蛋白技术在肿瘤治疗方面不断取得进展,但全人抗体与毒素融合蛋白治疗肝癌的研究国内还未见报道;因此,为了探讨全人重组免疫毒素在肝癌的导向治疗中的作用,本研究采用基因工程技术,将全人源c-Met单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE38KDEL基因重组,构建原核表达载体pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL,探索其在大肠杆菌TOP10中的诱导表达情况及表达条件。对诱导产物纯化后,得到抗肝癌免疫毒素c-Met/PE38KDEL,初步确定对人肝癌细胞系SMMC7721的生长抑制作用,从而制备出具有一定临床应用潜能的特异性全人源抗肝癌免疫毒素,为今后肝癌的临床导向治疗研究提供技术贮备。 研究方法 1.以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板设计引物,扩增出人源抗c-Met单链抗体基因,为便于克隆和表达,在引物两端引进合适的酶切位点和保护性碱基。以质粒pComb3XTT/c-MetFab(AM2-26)为模板,进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物纯化后,将其克隆入pMD-18Tvector,挑选阳性克隆测序。 2.用Nco1、EcoR1双酶切pMD-18T/c-Met质粒,将c-Met基因片段与经过同样双酶切的pBAD/GⅢA/PE38KDEL质粒进行黏端连接,连接产物转化E.coliTG1,PCR及Nco1、EcoR1双酶切鉴定pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL重组质粒。 3.左旋阿拉伯糖诱导表达蛋白,SDS-PAGE与Westernblot初步鉴定蛋白表达结果。对c-Met/PE38KDEL表达产物进行分离,分别采用SDS-PAGE与Westernblot检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量。8mol/L尿素对c-Met/PE38KDEL包涵体进行变性,HisTrap亲和柱纯化变性液,稀释复性法进行蛋白复性。采用流式细胞术,检测纯化蛋白与人肝癌细胞SMMC-7721的结合活性。 4.采用MTT检测不同浓度的c-Met/PE38KDEL对人肝癌细胞系SMMC-7721的生长抑制作用,并求出半数抑制量IC50。 研究结果 1.PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示,用设计的重链、轻链引物,可分别扩增出重链、轻链基因,大小约350bp左右,再通过OverlapPCR可扩增出大小约750bp的c-Met单链抗体基因,与预期大小一致。序列测定结果表明,其序列与已知序列相一致。 2.将测序正确的c-Met单链抗体基因经一系列酶切、连接、转化步骤,获得pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDE表达质粒。重组质粒的酶切及电泳:NcoⅠ、HindⅢ双酶切显示1830bp左右DNA片段,符合c-Met/PE38KDEL基因片段大小,NcoⅠ、EcoⅠ双酶切显示750bpDNA片段,符合c-MetscFv基因片段大小,EcoRⅠ、HindⅢ双酶显示1080bp左右DNA片段,符合PE38KEDL基因片段大小。重组质粒测序结果显示scFv3′端与PE38KDEL5′端碱基连接正确,读码框不变。 3.融合基因经0.02%左旋阿拉伯糖37℃诱导表达4h,获得C-末端带有多聚组氨酸(His)6标签序列的重组融合表达蛋白(70ku)。超声裂菌法分离的结果显示pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL的融合表达蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。融合蛋白经变性、HisTrap柱纯化及复性,流式细胞术结果显示:c-Met/PE38KDEL免疫毒素具有与人肝癌细胞株SMMC-7721(c-Met阳性)特异性结合。 4.流式细胞术结果显示,重组免疫毒素c-Met/PE38KDEL可诱导人肝癌细胞系SMMC-7721凋亡,且存在着剂量-效应关系;MTT结果显示,c-Met/PE38KDEL对SMMC-7721细胞具有较好的杀伤作用,浓度与A540nm值之间具有较明显的相关性,呈剂量-效应关系,IC50为8.32ug/ml。 结结论 1.成功克隆了人源抗c-Met单链抗体基因; 2.正确构建了c-Met/PE38KDEL融合基因并成功表达融合蛋白; 3.重组免疫毒素c-Met/PE38KDEL对人肝癌细胞系SMMC-7721有较好的生长抑制作用。……   
[关键词]:c-Met;PE38;免疫毒素;肝细胞癌;表达;纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2009年