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樱桃谷鸭CD8α胞外区多肽的原核表达、抗体制备及初步应用

白家媛

   本试验通过克隆测序樱桃谷鸭和麻鸭CD8αORF基因,应用生物学软件进行预测分析得出樱桃谷鸭与人的CD8α胞外区的氨基酸相似形比较大。利用克隆表达技术对樱桃谷鸭的CD8α胞外区基因进行表达,制备兔抗樱桃谷鸭CD8α多克隆抗体,同时应用SABC免疫组化方法观测鸭的外周血的CD8+T细胞变化规律,为鸭细胞免疫方面的研究提供手段,其主要研究内容如下。 1樱桃谷鸭和麻鸭CD8αORF的克隆测序及序列分析 本试验通过对已公布北京鸭CD8α开放阅读框基因序列特征设计了一对特异性的引物,克隆了樱桃谷鸭和麻鸭CD8α基因,并公布了樱桃谷鸭和麻鸭的序列,其登录号分别为FJ527828和FJ528914。通过相关软件分析了不同种属动物其基因特征得出,樱桃谷鸭与麻鸭和北京鸭的CD8α氨基酸序列相互之间相似性差异最大的在胞外区,而其他区域相对保守;由以上分析结果,本人选取了差异性比较大的胞外区又进行了比较,发现樱桃谷鸭、麻鸭和人CD8α胞外区亲水性、抗原性以及该区域在蛋白质表面的功能都有明显差异。 2樱桃谷鸭CD8α胞外区的原核表达 由上面的基因比较之后,本人针对差异性比较大的胞外区,设计一对特异性的引物,用来克隆其区域基因。同时还对此基因序列构建了重组表达质粒pGEX-KG-DuCD8α,在E.coli BL21中通过对转化了重组质粒的基因进行诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,在蛋白质电泳中43.8KDa位置处出现了明显的的蛋白条带;通过Western-blot分析在融合标签蛋白大约43.8Kda处有明显的抗原条带出现,证实本人对樱桃谷鸭CD8α胞外区多肽成功表达了。 3抗樱桃谷鸭CD8α胞外区多克隆抗体的制备及初步应用 对表达的包涵体蛋白进行纯化后作为免疫原,将与所获得的兔抗鸭免疫血清作为一抗,通过ELISA方法测定了兔抗rDuCD8α抗体效价为1:51200。在鸭瘟病毒感染后,非感染组CD8+T淋巴细胞数占淋巴细胞总数的百分比为29-32%,处于一个相对高的表达水平,而感染组CD8+T淋巴细胞百分比为10-21%,相对非感染组其表达水平较低,在感染后1到3天外周血液中CD8+T淋巴细胞比值缓慢下降,第3天以后比值缓慢上升,但表达水平都低于非感染组,另一个现象是,在部分嗜中性粒细胞细胞的表面免疫组化染色有阳性信号的出现。 结果表明本研究成功表达CD8α胞外区多肽,制备的兔抗樱桃谷鸭CD8α多克隆抗体可用于检测鸭外周血中CD8+T淋巴细胞。……   
[关键词]:DuCD8α;原核表达;序列分析;抗体;CD8~+T淋巴细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年