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棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析

龚文芳

   棉花是我国重要的经济作物,在国民经济和社会发展中占有重要的地位。由于我国人多地少,粮棉争地的矛盾非常突出,短季棉品种在我国麦棉两熟或多熟制栽培体系发挥着重要的作用。而短季棉的早熟早衰问题严重影响棉花的产量和纤维品质,培育早熟不早衰棉花新品种是棉花育种的热点领域,因此克隆与早衰有关的基因对于通过基因工程途径改良棉花品种具有重要的意义。研究主要结果如下: 1、从由本实验室构建的短季棉中棉所36号花发育期均一化cDNA质粒文库中随机选取3943个克隆进行测序,经Phrad软件进行编辑后,获得长度大于100bp的有效序列3872条,其序列的平均长度为493bp。利用Phrap软件对中36花发育期3872条有效EST序列进行片段重叠群分析和拼接后共获得3734个独立基因,其中包括125个片段重叠群和3609个独立的ESTs。在3872条序列中,有96.65%的序列是单一序列,约3.35%的序列重复次数在2-5次,仅有一条序列重复5次。所有有效序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对,发现有一条EST与柑橘中抗细胞凋亡基因DAD1存在91%的同源性。 2、以短季棉早熟早衰品种中棉所10号真叶为材料,分别提取基因组DNA和总RNA,然后反转录成cDNA,利用染色体步移技术,克隆了棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1,该基因cDNA全长866bp,包含232bp的5 非编码区以及280bp的3 非编码区,编码区为354bp,起始密码子处基本符合Kozak序列原则,通过比较分析DNA序列和cDNA序列发现GhDAD1基因有五个外显子,四个内含子,且符合GT-AG法则。系统进化树分析表明棉花GhDAD1与山杨、柑桔、拟南芥进化关系比较近,而与单子叶植物例如大麦、水稻进化关系比较远。应用DNASTAR软件对棉花基因GhDAD1核苷酸序列进行翻译,得到相应的氨基酸序列,共编码117个氨基酸,预测相对应的蛋白质相对分子式为C587H924N148O159S6,等电点为8.32,属于碱性蛋白质,位于内质网膜上 3、半定量PCR分析表明,GhDAD1基因在棉花各个组织中均表达,但在花和种胚等幼嫩组织中表达量较高,而在20天后的纤维以及根中等衰老组织比较少。QRT-PCR分析表明,随着棉花子叶的衰老,叶绿素含量不断下降,子叶中GhDAD1的表达逐渐降低。 4、以陆地棉品种中棉所10号幼苗为材料,对其进行诱导衰老培养,分别对其进行6-BA,乙烯、水杨酸、NO、H2O2处理,并同时测定叶绿素的含量。QRT-PCR分析表明6-BA、水杨酸处理能够延缓衰老,增加GhDAD1的表达量;乙烯能够加速衰老,降低GhDAD1的表达量;H202对GhDAD1的表达量的影响不大;而NO不同浓度影响不一样,随着浓度的升高,GhDAD1的表达量先升高后降低。 5、以GhDAD1基因片段为探针,对陆地棉品种中棉所16号体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以检测到GhDAD1基因的杂交信号,发现有8条染色体上都含有该基因或基因家族。利用RT-PCR在代表A染色体组的亚洲棉和代表D染色体组的雷蒙德氏棉中扩增GhDAD1,发现A、D染色体组都含有该基因,并通过序列测定发现该基因在A、D染色体组中非常保守。在拟南芥、柑橘以及大麦中,DAD1家族都含有两个同源性非常高的DAD1基因,即DAD1-1和DAD1-2,我们在棉属四倍体种中也检测到了8个较清晰的该基因的杂交信号,从信号的位置可以发现,该基因家族主要分布在靠近染色体着丝粒的长臂上。 6、分别构建了棉花GhDAD1基因的组成型启动子CaMV35S的植物转化正反义载体PBI121-GhDAD1s和PBI121-GhDAD1antis,检测鉴定后分别将它们导入农杆菌LBA4404。此外还构建了棉花GhDAD1原核表达载体,并导入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,在沉淀里分离出18.8KD的GhDAD1组氨酸融合蛋白,与预期相符。……   
[关键词]:陆地棉;抗细胞凋亡基因;GhDAD;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年