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猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究

刘源

  猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的高度接触传染性呼吸道疾病(Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP),重创了全球畜牧业。 胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子众多,各种毒力因子在APP致病过程中的角色及其相互作用的关系形成了错综复杂的网络。病原菌在感染过程中通过双组分调控系统(Two-Component Regulatory System, TCS)密切感受各种条件下因素的变化,从而调节多种基因的表达来适应新的宿主微环境以完成其致病过程。 经全基因组序列分析发现胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03菌株存在五对TCSs,即arcA/arcB、cpxA/cpxR、narQ/narP、phoB/phoR、ygiY/ygiX。 硝酸盐是很多细菌在厌氧生长条件下最偏爱的电子受体。narQ/narP是E.coli以及巴斯德科属的细菌感应硝酸盐信号的TCS,与许多菌属的narX/narL具有很高同源性,在许多病原菌中都存在这对双组分调控系统。在E.coli中narQ/narP与narX/narL具有相互调节作用。作为一种兼性厌氧菌,通过比较基因组分析发现,所有已测序的APP菌株中均无narX/narL存在。那么,narQ/narP是通过怎样的调控机制来影响APP的功能? 鉴于上述背景,在本实验室已经完成的国内流行的APP血清3型JL03菌株全基因组测序基础上,以国内流行的强毒株APP血清1型SLW01菌株为亲本,开展了narQ/narP双组分调控系统可能的调控机制的研究。本研究首先使用两步交换同源重组的方法,利用SacB蔗糖负向筛选结合氯霉素正向筛选作为标记基因构建了SLW01的narQ、narP单基因和narQ/narP双基因缺失突变株,研究narQ/narP敲除后细菌的遗传稳定性、生长特性、溶血性、外观形态、毒力等发生的变化,并运用表达谱芯片和荧光定量PCR,筛选突变株与亲本株的差异表达基因,分析narQ/narP可能参与调控的基因,为APP致病机理的深入研究奠定前期基础,并为APP毒力因子相互调控网络及药物靶标设计等提供理论基础。主要研究内容包括: 1.JL03中narQ, narP生物信息学分析 参照NCBI中APP血清3型JL03菌株生物学信息,对JL03中双组分调控系统narQ/narP在基因组上的位置,转录方向,碱基组成,G+C含量及保守性区域进行分析,绘制进化树。分析表明,双组分在基因组上的位置相距较远,二者转录方向相反,narP位于正链,narQ位于负链,二者在细菌种属进化中较为保守,与曼氏杆菌属相应蛋白的亲缘关系最近,二者分别符合HK和RR的一般结构特点。 2.ΔnarP/ΔnarQ/ΔnarPQ基因缺失菌株的构建及鉴定 从SLW01中扩增narP和narQDNA的上下游片段,将得到的上下游片段依次连接到重组转移质粒pEMOC2,构建重组转移质粒pEMAnarP和重组转移质粒pEMAnarQ。 ΔnarP的构建是以转化了重组转移质粒pEMΔnarP的E.coliβ2155为供体菌,APP血清1型菌株SLW01为受体菌进行接合转移,采用基于SacB蔗糖负向筛选结合两步交换同源重组的方法构建的。同样,ΔnarQ是以转化了重组转移质粒pEMΔnarQ的E.coliβ2155为供体菌,APP血清1型菌株SLW01为受体菌采取同样的接合转移的方法进行。在ΔnarP的基础上,用转化了质粒pEMΔnarQ的E.coliβ2155作为供体菌,ΔnarP作为受体菌进行接合转移,用同样的方法构建了双基因缺失株ΔnarPQ。通过序列分析,发现目的基因已经缺失;RT-PCR结果显示,突变株中无目的基因转录信号。结果表明缺失株构建成功。 3.ΔnarP/ΔnarQ互补菌株(CnarP, CnarQ)的构建及鉴定 从SLW01基因组中扩增narP, narQ的DNA,将其连接入E.coli-—胸膜肺炎穿梭质粒pJFF-XN构建重组表达质粒pJFF-narP, pJFF-narQ,将质粒分别电转化入SLW01菌株中,获得ΔnarP、ΔnarQ的互补菌株(CnarP, CnarQ),使用RT-PCR对其进行验证。结果表明互补菌株构建成功。 4.反应调控蛋白narP的表达 扩增SLW01中narP基因,将其连接入原核表达载体pET-28a构建原核表达质粒pET-narp。将质粒转化入E.coli (BL21)后用IPTG对其诱导表达,SDS-PAGE检测其表达活性。结果IPTG诱导6小时,获得E.coli重组narP蛋白。narP可以稳定表达。 5.基因缺失菌株生物学特性的研究 将AnarP、ΔnarQ、ΔnarPQ缺失菌株分别在平皿上连续传20代,每代都使用PCR鉴定其遗传稳定性,结果表明,三种缺失株都能够稳定的遗传;将缺失株与亲本株的单菌落接种于9%绵羊血平皿培养23h测定ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarQ的溶血活性,结果显示溶血活性无显著差异;对缺失株和亲本株的生长速率进行比较,绘制ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ生长曲线,分析表明ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ与亲本菌比较,在对数生长期缺失株比亲本株生长稍慢;将缺失株和亲本株在TSA平皿培养7h经固定液固定,用扫描电镜观察其外观形态有无变化,结果表明外观形态无明显差异。本研究测定了APP亲本菌和ΔnarP缺失菌对Balb/C小鼠的LD50,结果显示,与亲本菌SLW01比较,ΔnarP的毒力有所降低,其互补株CnarP与亲本株相比毒力稍有所升高。 6.缺失株与亲本株差异表达基因的筛选和功能聚类分析 将SLWO1、ΔnarP、ΔnarQ和ΔnarPQ同时分别在有氧和厌氧条件下培养,利用APP表达谱芯片分析菌株对数期的转录谱,对芯片杂交的原始数据统计分析,找出了缺失株与亲本株有明显差异表达的一些基因。使用荧光定量PCR验证芯片结果的可靠性。进一步对一些基因进行了功能及聚类分析。 有氧条件下与SLW01相比,ΔnarP差异表达基因有75个,而ΔnarQ差异表达的基因有31个,以及ΔnarPQ有21个 厌氧条件下条件与SLW01相比,ΔnarPQ双基因缺失突变株差异表达基因达84个,ΔnarQ有61个,ΔnarP有22个 SLW01在厌氧与有氧培养条件下相比,总有153个基因在转录水平上出现了明显变化。有41个基因上调表达,有112个基因下调表达。……   
[关键词]:胸膜肺炎放线杆菌;双组分调控系统;narQ/narP;基因缺失;生物学特性;差异表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年