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多西环素间接竞争ELISA检测方法的建立

沈亚安

   多西环素(Doxycycline, DOX)是一种常用兽用抗生素,是动物源性食品中最常见的兽药残留之一,当不遵守休药期或不按规范添加用药时,DOX就会残留在动物组织及其副产品中(包括蛋、奶)。残存于动物产品中的DOX及其代谢产物会严重威胁人类健康。 在国内及国外已经建立起了多种检测DOX药物残留的仪器检测方法,虽然其中有些方法在灵敏度、精确度上都比较令人满意,但由于操作步骤繁琐(复杂的样品处理过程等)、消耗时间多、费用较高、对操作人员技术要求全面等原因而不适合基层及大批量样品的检测。免疫学检测方法以其较高的敏感性、特异性,和简便性等优点被广泛应用于兽药残留检测领域。本研究旨在建立动物性产品中DOX残留的间接竞争酶联免疫(ic-ELISA)检测方法,为进一步试剂盒的开发应用奠定基础。研究内容与结果如下: 1.多西环素抗体的制备与鉴定。 通过人工合成抗原,免疫3-4月龄雄性新西兰大白兔,产生了针对DOX的特异性抗体,经间接ELISA检测多克隆抗体效价最高达1:80,000。并采用辛酸-硫酸铵法及G200过滤纯化。 2.多西环素间接竞争ELISA条件的优化。 采用间接及间接竞争ELISA方法确定了抗原、抗体工作浓度分别为0.5μg/mL和1:32,000的抗体稀释倍数,最佳包被条件为4℃下过夜,最佳抗原抗体竞争反应时间为15 min。 3.多西环素间接竞争ELISA检测方法的建立。 采用ic-ELISA方法,建立标准曲线,得到DOX的半数抑制(IC50)值为8.74μg/L,检测限为1.96μg/L。该方法检测范围为1.96-160μg/L。批内平均变异系数在肝脏和肌肉样品中分别为5.75%和7.53%;批间平均变异系数在肝脏和肌肉样品中分别为5.92%和7.21%。交叉反应试验表明除土霉素有10.71%的交叉反应外,其他类似结构交叉反应均较弱。这些结果表明采用ic-ELISA检测多西环素的方法是可行的。 4.样品添加回收试验。 将高、中、低三个浓度的DOX添加到未接触DOX猪的空白的肝脏和肌肉样品中,通过添加回收试验,DOX在肝脏中的回收率在80.19-89.41%;在肌肉中的回收率在83.98-94.75%。结果表明ELISA条件优化,及样品抽提方法有较高的可信度。……   
[关键词]:多西环素;多克隆抗体;ic-ELJSA;添加回收试验
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年