手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

鸡新城疫抗体检测试纸条的研制及初步应用

贾清

   鸡新城疫(Newcastle disease, ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒属的1型副粘病毒(Paramyxo virus)新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种极易传染的毁灭性疾病,该疾病严重地阻碍了世界养禽业的发展。 检测鸡群的免疫水平和评价鸡群的免疫状况对于该病的控制有着重要的意义。而目前,新城疫抗体检测技术主要局限于实验室检测,在临床应用时有一定的局限性。本研究利用原核表达血凝素神经氨酸酶蛋白,结合胶体金免疫层析技术,建立了鸡新城疫病毒抗体快速检测方法,取得以下研究结果: 1.新城疫血凝素神经氨酸酶蛋白的原核表达及纯化 用本实验室保存的NDV La Sota株通过鸡胚传代,收取尿囊液后提取病毒RNA,分别设计带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的两对引物,利用RT-PCR扩增出HN基因的全长和去信号肽和跨膜区序列的片段,将两种扩增产物分别克隆进pGEX-KG载体,成功构建了重组表达质粒pKG-HN和pKG-HNde-sp,测序后,两条基因大小分别为1734 bp和1593 bp,扩增序列与GenBank上报道的La Sota株的基因核苷酸序列的同源性为99%。将构建好的pKG-HN和pKG-HNde-sp质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导后,经SDS-PAGE电泳分析,重组表达的蛋白分子量分别约为89 KD和80 KD。经过对表达蛋白的条件进行优化,结果显示,pKG-HNde-sp在温度为37℃、IPTG浓度为1‰和诱导5 h的表达量最高,Western-Blot分析表明,表达蛋白有较好的免疫学活性。 2.鸡新城疫病毒抗体快速检测试纸条的建立 用柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金,用鼠抗鸡IgG Fc单抗标记,标记的最佳pH为8.0,最佳标记量为9.6μL1.0mg/mL。以金标鼠抗鸡IgG Fc单抗为探针,以兔抗鼠IgG作为质控线,以纯化的HN蛋白作为检测线的捕获试剂,初步建立了能检测鸡新城疫抗体的胶体金快速检测试纸条。兔抗鼠IgG的最佳喷膜浓度为1.0mg/mL, HN表达蛋白的最佳喷膜浓度为1.1 mg/mL。该试纸条与传染性法氏囊、传染性支气管炎、禽流感H9亚型、禽流感H5亚型、鸡毒霉形体等阳性血清和无特定病原体鸡阴性血清反应均为阴性;灵敏度与血凝抑制试验结果一致。该方法操作简单,特异性强,灵敏度高,可用于鸡新城疫血清抗体水平的检测。 3.鸡新城疫抗体快速检测试纸条的初步应用 用本试验制备的鸡新城疫抗体快速检测试剂盒进行临床应用,检测240份血清,其中试纸条检测出阳性血清222份,检出率为92.5%(222/240);血凝抑制试验(HI)检测出阳性血清220份,检出率为91.6%(220/240),二者的符合率为99.1%(220/222),此结果表明,本试剂盒与HI试验结果基本一致,临床上可代替HI试验进行新城疫抗体效价的检测。……   
[关键词]:新城疫病毒抗体;HN蛋白;胶体金;免疫层析技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年