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猪白细胞介素-34(pIL-34)的分子克隆、表达和生物学活性验证

胡犇

   白细胞介素是一类具有重要免疫调节功能的蛋白质,对提高机体的免疫机能、抵抗病原感染具有积极作用。白细胞介素-34(IL-34)是2008年首次报道的一种新型白细胞介素,目前已知IL-34具有增强单核细胞活力、调节髓样细胞生长分化、加速破骨细胞形成等生物学功能,对IL-34的理化特性、功能、作用机制、表达调控等方面的认识还极为有限。而有关猪IL-34的研究还暂未有文献报道,鉴于此,本研究针对猪IL-34开展了基因克隆、表达及促进猪外周血单核细胞增殖的活性等方面的研究,主要研究内容包括: 1.猪IL-34的克隆与序列分析根据与人IL-34mRNA序列具有高同源性的猪EST序列(CJ032290)设计引物pIL34-F/R,以poly(I:C)刺激的PK-15细胞的总RNA为模板,RT-PCR扩增获得猪IL-34完整编码区cDNA序列,并将其克隆至pMD18-T载体。测序结果显示,克隆到的序列全长708bp,编码235个氨基酸,该序列与猪EST数据库中的参考序列同源性为99.44%。根据ClustalW2序列比对结果,猪IL-34与人、牛、小鼠、大鼠IL-34氨基酸序列的同源性分别为:78%、85%、71%和71%。 2.猪IL-34的组织差异表达分析 以采自同一头6周龄梅山猪的多种组织器官RNA为模板,半定量RT-PCR分别扩增目的基因IL-34和内参基因GAPDH,分析猪IL-34在不同组织中的表达差异。结果表明猪IL-34 mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,其中以小肠中的表达水平最高,其次为脑,在脾、肺、肾中的表达量较低,而在胃、肝和淋巴中几乎没有表达。 3.猪IL-34的原核表达与多克隆抗体的制备 PCR扩增去除猪IL-34完整编码区前60个编码信号肽的核苷酸的片段,插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-pIL34,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,,SDS-PAGE检测证实带有6个组氨酸标签的猪IL-34成熟肽融合蛋白能在大肠杆菌BL21中表达,表达产物大小约为23kDa,并且主要以不溶性包涵体形式存在。进一步以抗6个组氨酸的单抗为一抗,通过Western blot检测证实了表达蛋白的特异性,随后以表达产物为抗原免疫新西兰兔制备了兔抗猪IL-34的多克隆抗体。 4.猪IL-34的真核表达 构建了表达猪IL-34的真核表达质粒pcDNA-pIL34,转染CHO细胞,G418筛选获得稳定表达猪IL-34的CHO细胞系。并采用RT-PCR和Western blot从mRNA水平和蛋白质水平上证实猪IL-34在所构建的细胞系中获得表达。 5.猪IL-34生物学活性的初步验证 收集稳定表达猪IL-34的CHO细胞系培养上清,以及pcDNA-pIL34真核表达质粒瞬时转染HeLa细胞后不同时间的培养上清,通过MTT法,检测猪IL-34促进猪外周血单核细胞增殖的能力。结果显示两种培养上清均具有促进外周血单核细胞增殖的活性,但两种培养上清促进外周血单核细胞增殖的能力都不强。……   
[关键词]:猪IL-34;克隆;原核表达;真核表达;生物学活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年