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流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立

刘宏

   流行性造血器官坏死病(Epizootic hematopoietic necrosis, EHN)是由EHN病毒引起的红鳍鲈鱼和虹鳟鱼的一种全身性病毒性疾病。随着我国水产业迅速发展,水生动物疫病日益增多,特别是由EHN等病毒引起的流行性疫病危害更为严重。本研究针对我国水生动物疫病现状,以本实验室引进和保存的EHN病毒为材料,进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究,并在此基础上,克隆表达了EHNV的主要衣壳蛋白(MCP),初步建立了基于MCP蛋白的EHN病毒感染的ELISA检测方法,取得了如下结果: 1.EHN病毒的增殖和鉴定 利用对流行性造血器官坏死病毒(EHNV)敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)增殖病毒;测定了病毒毒力和培养液中的病毒滴度;采用蔗糖密度梯度离心法对收获的病毒进行了纯化;通过SDS-PAGE和Western blotting方法对纯化病毒进行了病毒组份鉴定和免疫学活性分析,为后续EHNV高免血清的制备及ELISA检测方法的建立奠定了基础。 2. EHNV-MCP基因的克隆与高效表达 参照GenBank已发表的流行性造血器官坏死病毒(EHNV) MCP基因序列,以本实验室保存的EHNV毒株为实验材料,提取DNA,将用PCR方法扩增得到的MCP基因克隆到pMD18-T载体上,对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,扩增片段的长度为1392bp,所测得的基因序列与GenBank上所报道的EHNV的MCP序列同源性在99%以上。将重组基因插入原核表达载体pET-32a,成功构建了重组表达质粒ET-32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达;对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果与预期蛋白大小一致,Western blotting检测表明,该表达蛋白具有良好的免疫学活性。 3.EHN病毒ELISA-MCP检测方法的初步建立 用纯化的EHNV免疫新西兰大耳白兔和Balb/c小鼠,制备高免血清。以亲和纯化的兔抗EHNV IgG为包被抗体,鼠抗EHNV IgG为第二抗体,建立了检测EHNV的双抗体夹心ELISA方法,并对影响ELISA反应的各种条件进行了优化。结果表明,兔抗EHNV IgG的最佳包被浓度为0.5μg/mL,鼠抗EHNV血清的最适工作浓度约为1:12800;与已知流行性造血器官坏死病标准病毒呈强阳性反应,与已知的阴性样品及其它一些鱼类病毒无交叉反应。该方法的建立,为我国水生动物EHN病毒的常规检测提供了技术手段。……   
[关键词]:流行性造血器官坏死病毒;克隆表达;ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年