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猪β-防御素2多克隆和单克隆抗体的制备及初步应用

谭雯雯

   抗菌肽是由动物机体自身分泌的抵抗外界病原微生物的一类微量的重要蛋白质,它在动物的先天免疫中发挥十分重要的作用。因其独特的抗菌机制、广泛的抗菌谱以及不易产生耐药性等特点,近年来成为研究的热门。防御素是其中一类重要的小分子阳离子抗菌肽。目前有不少研究者试图通过转基因动物大量表达防御素,以增强转基因动物的抗病能力。为了建立检测猪β-防御素2(PBD2)在猪和转基因动物中的表达,本研究制备了PBD2的多克隆抗体和单克隆抗体,建立了间接免疫荧光和免疫组织化学检测方法。 本研究根据PBD2的氨基酸序列,人工合成了PBD2的11肽,与钥匙孔血蓝蛋白KLH偶联成全抗原PBD2-KLH,免疫Balb/C小鼠,三次免疫后,以合成的37肽作为PBD2抗体的检测抗原,检测小鼠血清效价,均达到1:12800以上,取其血清制备小鼠抗PBD2的多克隆抗体,并利用该鼠源PBD2多抗建立了PBD2的间接免疫荧光检测方法。 通过间接ELISA方法筛选出抗体水平高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选出阳性克隆,用有限稀释法进行两次亚克隆,最后获得5株杂交瘤细胞株1C2、1F4、2H2、3A2和4B1,均能够稳定分泌特异性好、效价高的PBD2单克隆抗体,其细胞培养上清的抗体ELISA效价达到1:210以上,腹水的抗体的ELISA效价达到1:106以上。 分别取临床健康猪和胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074株感染猪的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、小肠等组织,用制备的单克隆抗体对其组织切片进行SABC免疫组化染色,分析PBD2在不同组织中的表达分布及表达差异。结果表明,猪PBD2在肝脏中表达量最高,PBD2主要分布于肝脏的血管内皮细胞,肝细胞中也有广泛分布,在细胞质和细胞核中均有分布。不同动物和组织中PBD2的表达差异需要进一步结合荧光定量PCR和双抗夹心ELISA进行验证。……   
[关键词]:猪β-防御素2;多克隆抗体;单克隆抗体;免疫组织化学;间接免疫荧光
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年