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恶臭假单胞菌表面展示细菌漆酶及对染料的脱色性能

王伟

   细菌表面展示系统是一种蛋白质应用新技术,已在多个生物技术领域显示出应用前景。本研究利用丁香假单胞菌冰晶核蛋白(Ice Nucleation Protein) InaQ的N-末端结构域作为运载蛋白,采用C-端融合的方法,将一种细菌漆酶成功展示在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) AB92019菌株的表面,然后对3种不同重复单元InaQ-N、(InaQ-N)2和(InaQ-N)3作为运载蛋白表面展示细菌漆酶的性能进行了比较分析,并对优化系统进一步用于染料脱色的性能进行了研究。 从携带细菌漆酶基因的重组质粒pMB172中通过PCR反应扩增得到突变型漆酶基因wlacD,然后酶切连接至分别含有1、2和3个inaQ-N基因重复的表达载体pMB104、pMB111和pMB112,构建得到分别含有融合基因inaQ-N-wlacD、(inaQ-N)2-wlacD和(inaQ-N)3-wlacD的重组质粒pMB281、pMB282和pMB283,并通过电转化导入恶臭假单胞菌AB92019菌株,筛选得到恶臭假单胞菌表面展示重组菌MB284、MB285和MB286。经对重组菌的SDS-PAGE、Western Blot、免疫荧光显微镜镜检以及流式细胞仪分析,结果证明重组菌MB284、MB285和MB286均能成功地在细胞表面分别展示其融合蛋白InaQ-N-WlacD、(InaQ-N)2-WlacD和(InaQ-N)3-WlacD。通过对3个重组菌全细胞漆酶酶活的检测发现,表面展示(InaQ-N)2-WlacD融合蛋白的重组菌MB285酶活最高,达到6.9U/mL。因此,选择重组菌MB285进行染料的脱色研究。 选取酸性绿和酸性红2种染料进行脱色试验。实验结果发现,重组菌MB285对两种染料均具有明显的脱色性能,其中对酸性绿的脱色率达到35.5%,对酸性红的脱色率达到17%。 对重组菌在优化培养条件下对两种染料的绝对脱色性能进行了考察。测定了重组菌MB285的全细胞酶活曲线,发现该曲线与重组菌的生长曲线具有同步性。通过单因子试验探讨重组菌MB285的摇瓶发酵条件(培养温度、初始pH、装液量和接种量)对生长量的影响。确定最佳培养条件为初始pH7.0,培养温度30℃,装液量20%和接种量4%。通过单因素和正交试验确定重组菌MB285发酵培养基的最佳配比为(W/V)2%葡萄糖、3%玉米浆、2%硫酸铵、0.2%氯化钠、0.08%MgSO4·7H2O和0.05% K2HPO4·3H2O。筛选出的优化培养基活菌数为1.1×1011CFU/mL,与优化前相比提高了约2.3倍。重组菌MB285摇瓶发酵优化后绝对脱色效率明显的提高,对酸性绿的绝对脱色率由优化前的36.5%提高到优化后的45%,对酸性红的绝对脱色率由优化前的17.9%提高到优化后的28%。……   
[关键词]:细胞表面展示;恶臭假单胞菌;冰核蛋白;细菌漆酶;脱色
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年