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天蓝放线紫红素生物合成上调基因的克隆及其对阿维菌素产量的影响

余姣姣

   放线紫红素和阿维菌素都属于聚酮类抗生素,其中放线紫红素由天蓝色链霉菌通过Ⅱ型聚酮合酶(PKS)途径合成,阿维菌素由阿维链霉菌通过Ⅰ型PKS途径合成。天蓝色链霉菌A3(2)和阿维链霉菌NRRL8165基因组测序已经完成。比较研究不同链霉菌对次级代谢的调控作用有重要理论价值,同时也对相关抗生素工业生产有指导意义。 本论文在实验室初筛获得11个对放线紫红素合成有上调作用的天蓝色链霉菌基因组文库粘粒的基础上展开研究,利用属间接合转移系统将11个粘粒分别转到天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌1326中,发现SCOL5E7, SCOL6G2, SCOL5C10, SCOL5C12, SCOL5F10, SCOL5B9在两种菌中皆对放线紫红素合成有上调作用。将这6个粘粒导入阿维链霉菌NRRL8165,经摇瓶发酵和HPLC检测,发现SCOL5B9对阿维菌素多个组份合成均有明显上调作用,其中组分B1a产量提高8倍;其它粘粒没有明显作用。通过粘粒末端测序并亚克隆,将SCOL6G2中对放线紫红素表达有上调作用的基因定位到SCO0431和SCO0432,分别编码一个可能的分泌蛋白和一个可能的胞外肽水解酶;其它粘粒中的功能基因定位尚无定论。 阿维链霉菌可作为异源表达抗生素生物合成基因簇的良好宿主,但是需要优化含有大片段DNA质粒的接合转移效率。我们选取MgCl2、NaCl、Ca(NO3)2和CaCl2等4种无机盐,在0-200 mM浓度范围内分别研究其对大质粒向阿维链霉菌接合转移的影响,发现CaCl2有极明显促进作用,MgCl2也有一定提高作用。进一步通过完全随机试验组合CaCl2、MgCl2,筛选出显著提高阿维链霉菌接合转移效率的最佳组合,使大质粒的接合转移效率提高11倍。同时,本研究还发现阿维链霉菌异源表达放线紫红素的最适培养基,成功表达放线紫红素,为进一步研究阿维链霉菌中放线紫红素生物合成的调控奠定基础。……   
[关键词]:次级代谢;调控因子;放线紫红素;阿维菌素;接合转移;异源表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年