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农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立

刘红梅

   百子莲是世界著名鲜切花和绿地植物之一,在花卉市场中占有重要的位置,但是,由于百子莲是引自非洲的一种热带花卉,抗寒性比价差,如何增强百子莲的抗寒性来增大其利用价值成为急需解决的实际问题。最近几年,随着生物技术的发展,为百子莲育种提供了新的思路。 本试验以野生型拟南芥基因组DNA为模板,克隆ATCBF1全长基因,然后将其插接到pMD18-T中,转入到大肠杆菌本DH5a菌株中。然后提取pMD18-T质粒和pCAMBIA1304进行双酶切,转化到农杆菌中。经测序检测后,目的基因被克隆到质粒中,位于CaMV35S启动子后的NcoⅠ和BglⅡ酶切位点间,构建CBF1的植物表达载体,接着将表达载体转入农杆菌EHA105中。 百子莲抗性植株筛选试验,根据百子莲的胚性愈伤组织和去根幼苗在含有0mg/L,5 mg/L,10 mg/L,15 mg/L,20 mg/L,25 mg/L六个潮霉素浓度的分化培养基和生根培养基中的分化成苗和幼苗生根状况,初步确定百子莲愈伤分化成苗的潮霉素筛选浓度为20 mg/L,幼苗生根的潮霉素筛选浓度为15 mg/L。 在建立百子莲遗传转化体系时,以百子连胚性愈伤组织做为受体组织,运用正交试验设计对预培养时间、菌液浓度、侵菌时间、预培养基AS的浓度、菌液中AS的浓度5个条件进行优化,利用每个处理的抗性愈伤率确定每个处理中合适的水平。结果表明:预培养5d、菌液浓度(OD600)=0.9、浸菌25min、预培养乙酰丁香酮(AS)的浓度为50μmol/L、菌液中AS的浓度为100μmol/L时,抗性愈伤率最高。采用GUS组织化学染色证明了试验的可行性,报告基因GUS基因在胚性愈伤组织细胞中能表达。 应用农杆菌介导转化法,转化百子莲胚性愈伤组织,然后放到含有抗生素Hyg20 mg/L的分化培养基上,进行筛选。待分化出胚状体,放到光下,分化成幼苗,然后将幼苗转接到含有Hyg 15 mg/L的生根培养基上,进行筛选4-5周。幼苗长出根,移栽出植株到基质中生长。 对抗性植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增初步检测,GUS组织化学染色在白色的背景上观察到了蓝色斑点和成片的蓝色;对抗性植株进行PCR扩增初步检测,检测到了目的基因片段,检测17株,从11株中检测到了目的基因片段,初步说明AtCBF1目的基因已经被转化到百子莲的细胞中,并且整合到基因组中。……   
[关键词]:AtCBFI;百子莲;条件优化;抗性愈伤率;抗性苗检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年