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牛骨酶解制备血管紧张素转换酶抑制肽的研究

蔡丽华

   本文利用牛骨蛋白酶解制备血管紧张素转换酶抑制肽,在以下几个方面开展了研究: 研究了牛骨软化过程中骨蛋白的变化及实验室制备牛骨粉的营养价值;通过对牛骨的水解发现碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶对牛骨的水解效果较好;研究了酶解条件对牛骨蛋白酶解动力学参数的影响,根据动力学试验得到:碱性蛋白酶作用于骨蛋白的最适温度为55℃、pH为12,此时Vmax为0.10824 g/L·min,Km为11.71892g/L;中性蛋白酶作用于骨蛋白的最适条件温度为45℃、pH为7,此时Vmax为0.04724 g/L·min,Km为14.35711g/L;胰蛋白酶作用于骨蛋白的最适温度为55℃、pH为9,此时Vmax为0.05073g/L·min,Km为4.31516g/L。 从新鲜猪肺中提取了血管紧张素转换酶(ACE)的粗酶液,纯化后得到了比活力为5.21u的ACE酶液;通过水解度与ACE抑制率的关系研究发现不同蛋白酶水解的水解度与ACE抑制率的关系不同;在此基础上选用碱性蛋白酶作为酶解骨粉制备ACE抑制肽的工具酶,通过条件的优化得到的最适酶解参数为50℃、pH 10、底物浓度25%、E/S为0.4、酶解时间为3h。 利用葡聚糖凝胶色谱测定A3h的分子量分布,发现该混合肽主要分为3个组分,其中组分111分子量小于1000Da,且半抑制浓度最小为0.561mg/ml,抑制活性较高;利用5000Da的中空纤维膜进行超滤,得到的小分子混合肽进行氨基酸分析等定性分析。通过ACE抑制活性消化稳定性实验和ACE抑制动力学研究发现该混合肽为真抑制型的竞争性抑制剂。 收集已报道数据进行分析发现肽中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸对其ACE抑制活性有较大影响;利用大孔树脂富集疏水性氨基酸,确定了操作条件以50mg/ml骨肽上样浓度为佳,100%乙醇洗脱得到的组分ACE抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)为0.45mg/ml,组分得率为24.59%;利用颗粒活性炭富集芳香族氨基酸,确定了30mg/ml上样浓度为佳,利用100%乙醇+5%乙酸洗脱得到的组分IC50为0.59mg/ml。……   
[关键词]:牛骨粉;牛骨胶原蛋白;血管紧张素转换酶;ACE抑制肽
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年