手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

产金黄色葡萄球菌肠毒素A工程菌构建及其发酵条件研究

丁岚

   金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起食物中毒和医院化脓性感染的一种重要致病菌。其致病力的大小主要取决于其所产肠毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)的能力。SEs是一组结构相关、毒力相近、抗原性不同、分子量为24-32 KDa的单链,且具有超抗原活性的胞外蛋白,包括肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C等近二十种血清型。其中,以A型肠毒素(SEA)引起食物中毒的发生率最高。 本研究首先构建了SEA基因重组表达菌株(E.coli BL28-rSEA),然后对其培养与表达条件进行了优化,为后续大量制备SEA标准品奠定了基础。主要研究结果如下。 1重组SEA工程菌的构建与蛋白的表达、纯化 从野生型金葡菌ATCC 13565中克隆SEA基因插入含有His标签的原核表达载体pET28a(+)并转化大肠杆菌,成功构建能高效表达重组SEA蛋白(recombinant staphylococcal enterotoxin A, rSEA)的工程菌E. coli BL28-rSEA.采用Ni-NTA His Bind Resin的亲和层析方法对rSEA进行分离纯化,SDS-PAGE电泳表明BL28-rSEA产生的rSEA为28 KDa的融合蛋白,与相关文献报道一致。 2重组SEA工程菌的发酵条件研究 采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)对rSEA产量进行定量。研究了接种量、pH、温度、诱导时机、诱导时间、乳糖诱导浓度等对工程菌BL28-rSEA产rSEA的影响。结果表明,E. coli BL28-rSEA在接种量2%、pH 7.0、温度为37℃、对数生长期(OD600约为0.6),添加终浓度为0.6 mmol/L的乳糖诱导7 h,能获得10.6 mg/L的rSEA. 3rSEA工程菌的发酵培养基优化 首先,采用Plackett-Burman设计对产rSEA的工程菌E. coli BL28-rSEA培养基主要成份葡萄糖、蛋白胨、甘油等进行评价,然后用最陡爬坡试验对培养基成份的最适区域进行评估,最后采用Box-Behnken设计和响应面分析对被测因子的最佳浓度进行优化。结果表明,E. coli BL28-rSEA产rSEA的最佳培养基成份为(g/L):葡萄糖2.00,蛋白胨23.00, Na2HPO4·12H2O 21.00, NaH2PO4·2H2O 4.00,酵母浸膏2.60以及甘油36.48。在此条件下,诱导表达rSEA的产量可达33.17 mg/L,是未优化前培养基产量的1.84倍,是野生型金葡菌SEA产量的近9倍。……   
[关键词]:重组金黄色葡萄球菌肠毒素A;响应面方法;条件优化;间接竞争酶联免疫吸咐法
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年