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枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化烟草提高抗脱水研究

张庆福

   多胺是生物体在代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱,广泛存在于植物体内,在逆境胁迫中对植物具有保护作用。多胺主要有腐胺、精胺和亚精胺三种类型,其中精氨酸脱羧酶(ADC)是多胺合成中的关键酶之一,催化精氨酸脱羧生成鲱精胺(Agm),然后再由鲱精胺水解生成生成腐胺。本试验采用根癌农杆菌介导的叶盘法将枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化到烟草中,并对T2代转基因材料的抗性进行分析,主要结果有: 1.PCR检测及半定量分析:PtADC基因表达载体通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草,共获得12棵生根的抗性苗,以转基因烟草的基因组DNA为模板,进行PCR检测,以含目的基因的菌液质粒为阳性对照,以ADCR+35SF和NPTII引物均能扩增出特异的DNA片段,而野生型烟草植株未扩增出片段,说明pBI121-PtADC基因片段已经转入烟草基因组中;取其中的2株转基因株系进行半定量RT-PCR分析,结果表明PtADC基因在烟草中表达。 2.转基因烟草中腐胺含量测定:取2个超表达PtADC的T2株系进行脱水处理,然后进行腐胺的测定,结果表明脱水处理前和处理后,转基因烟草中腐胺含量都比对照的含量高。 3.转基因烟草离体苗的相对失水率:取播种60d的转基因和对照离体苗叶片,在室温下进行脱水处理,然后测定相对失水率。结果表明:脱水处理之后对照的相对失水率比转基因高,随着脱水时间的延长,对照叶片较转基因叶片严重萎蔫。 4.离体苗的相对电导率和叶片的相对温度:测定离体叶片在脱水处理前后的电导率和叶片相对温度,结果显示,在未处理时转基因材料和对照之间相对电导率的差异很小,而处理之后转基因材料的电导率低于对照,转基因叶片处理前后的相对温度都比对照的高。 5.离体苗的染色:叶片在脱水处理时会产生超氧阴离子和过氧化氢,对转基因材料叶片和对照叶片进行DAB和NBT染色观察。结果表明:脱水处理前,转基因叶片和对照叶片之间差异很小;而处理之后,对照的颜色比转基因深,暗示了叶片中产生的过氧化氢和超氧阴离子的含量比转基因中的多。 6.基因表达分析:提取转基因和野生型株系组织RNA,反转录为cDNA,进行半定量RT-PCR分析,结果表明,在处理前后,APX、DREB、SAMDC三个基因表达量比对照增强。……   
[关键词]:PtADC;多胺;逆境;脱水;转基因;烟草;活性氧
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年