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秦巴山区虎杖中产白藜芦醇(苷)内生真菌的分离鉴定

彭浩

   植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的一类真菌。自Strobel等于1993年首次从短叶紫杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出一株内生真菌(Taxomyces andreanae)能产生紫杉醇(taxol)后,利用微生物发酵被认为是解决植化药物短缺的潜在途径。虎杖(Polygonurn cuspidatum)是秦巴山区一种广泛分布的中药材,其活性成分白藜芦醇(苷)具有抗癌、抑菌消炎、保肝利胆、抗氧化和降血脂等多方面的药理活性。本研究以虎杖为材料,分离得到了一些内生真菌,通过对菌株的分类鉴定和代谢产物的初步分析表明,部分内生真菌能发酵产生白藜芦醇苷(醇),具体研究结果如下。 1虎杖内生真菌的分离、纯化及初步分类鉴定 采用组织分离法,将新鲜虎杖根清洗干净,并对其表面进行消毒后,剪切成0.5mm×0.5mm的小块,接入PDA平板中,于28℃培养3~7 d,分离、纯化得到116株内生真菌。形态分类结果初步表明,它们分别属于从梗孢目、壳霉目、黑盘孢目、毛霉目和无孢目5目,及曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、无孢类(Agonomycetaceae)、镰孢霉属(Fusarium)、毛霉属(Mucor)、拟盘多毛孢属(Pestalotia)、枝孢霉属(Cladosporium)、链隔孢属(Alternaria)及木霉属(Trichoderma)9属。 2产白藜芦醇(苷)虎杖内生真菌的筛选 将上述116菌株(还是部分代表菌株),分别接种于改良马铃薯液体培养基中,28℃,160r/min,培养7d后,按1:2(v/v或w/v)的比例,以乙酸乙酯分别对菌丝和发酵液萃取15min,合并萃取液,40℃真空旋转蒸发至干后,以甲醇溶解、定容至25 mL,并以HPLC测定提取液中白藜芦醇(苷)的含量。获得两株可产白藜芦醇(苷)的内生真菌,分别为M-56和L-18。其中,M-56只产白藜芦醇苷,产量为1.029 mg/L;L-18既产白藜芦醇苷又产白藜芦醇,含量分别为4.672和4.812 mg/L。 3产白藜芦醇(苷)虎杖内生真菌的鉴定 根据菌落形态及显微形态的观察结果,将M-56和L-18菌株初步鉴定为链格孢属(Alternaria)和青霉属(Penicillium)真菌。在此基础上,对两菌株的ITS片段进行扩增,得到长度均为564 bp的DNA片段。经测序并在NCBI数据库中进行ITS序列同源性比对,结果显示,M-56和L-18菌株的ITS序列分别和NCBI中收录的链格孢属及青霉属其它种的ITS序列同源性均为99%。结合形态学特征将M-56和L-18菌株鉴定为半知菌亚门丝孢目链格孢属(Alternaria)真菌和丛梗孢目丛梗孢科青霉属(Penicillium)真菌。……   
[关键词]:虎杖;内生真菌;白黎芦醇(苷)
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年