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蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究

余海芬

   本文采用多种现代分离技术对鸡蛋清中的溶菌酶进行了提取分离,比较了不同方法对分离效果的影响;并利用新兴的共振瑞利散射技术建立了溶菌酶的快速检测方法;另外对溶菌酶酶学性质及其体外抑菌活性进行了初步探讨。主要研究结果如下: 采用离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶,考察了离子交换树脂种类、用量、吸附反应时间、洗脱液浓度和洗脱时间等对溶菌酶提取效果的影响,采用三因素三水平正交响应面组合设计进行实验,对提取工艺进行了优化,建立了树脂用量、吸附时间、洗脱液浓度三个提取工艺参数间的数学模型Y=0.339667+0.041 X1+0.038375 X2-0.021375 X3+0.00925 X1X2-0.00425 X1X3-0.0105 X2X3-0.051583 X12-0.068833X22-0.039833 X32,得到最佳的提取工艺条件为:树脂用量占蛋清液体积的32%,吸附时间6.5 h,硫酸铵洗脱液的质量浓度为9.3%。在此条件下提取的溶菌酶得率为0.324%,酶活力为16300 U/mg。 将离子交换法制得的溶菌酶粗品用超滤法除盐,选择截留分子量为10000的聚醚砜膜,跨膜压力设为0.2 MPa,搅拌速度为200 r/min,研究了超滤除盐过程中浓缩液体积、膜通量以及脱盐率的关系,得出当超滤至浓缩液体积为原始料液体积的10%左右时,脱盐效果最好,可以除去90%以上的硫酸铵,此时溶菌酶得率为0.275%,酶活力为21500 U/mg。 此外,本实验还研究了超滤法直接从蛋清液中分离溶菌酶的工艺条件,探讨了跨膜压力、搅拌速度、料液稀释倍数及溶液pH值对膜通量和蛋白质渗透率的影响,得到最佳的超滤条件:0.1mol/L NaCl溶液以1:1(v/v)的比例稀释蛋清液,料液pH值6.5,跨膜压力0.2 MPa,搅拌速度200 r/min,在此条件下分离鸡蛋清中溶菌酶,得率为0.301%,酶活力为18200 U/mg。 以金纳米粒子作探针,建立了共振瑞利散射光谱法定量测定溶菌酶的方法。研究了金纳米-溶菌酶体系的共振瑞利散射(RRS)光谱、非线性散射(SOS和FDS)光谱和吸收光谱特征,并探讨了金纳米粒子与溶菌酶反应的最适宜条件,包括:溶液pH值、金纳米粒子用量、试剂混合顺序以及共存离子等,确定了反应的最优条件,结果表明共存离子对共振瑞利散射法测定溶菌酶的影响很小。本实验还初步探讨了导致体系共振瑞利散射光强度显著增强的原因。该溶菌酶检测方法灵敏度高,检出限为30.1 ng/mL,且具有较好的选择性,应用于合成样品和新鲜鸡蛋清样品中溶菌酶含量的测定,结果令人满意。 溶菌酶的酶学特性研究表明:其最适反应pH值约为6,最适反应温度为55℃;溶菌酶在pH值为6-7和温度为20℃-60℃范围内,能较好的保持酶活,且温度变化对酶活力影响很小;另外大部分金属离子能与溶菌酶产生良好的配伍作用,对酶活力影响不大,其中Na+、Ca2+、Mn2+对溶菌酶有一定的激活作用;几种表面活性剂都对溶菌酶活力有一定抑制作用,但抑制作用相对较弱。 溶菌酶的体外抑菌实验表明:其对大肠杆菌、沙门氏菌有很好的抑制效果,在较高浓度下对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用,对三种菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别是E.coli 0.313 mg/mL和0.625 mg/mL,S.aureus 1.25 mg/mL和5.0 mg/mL,Salmonella 0.625 mg/mL和1.25 mg/mL。……   
[关键词]:溶菌酶;离子交换;超滤;共振瑞利散射;酶学性质;体外抑菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年