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氚标乙酰甲喹的合成及其在动物体内的处置研究

尹伏军

   乙酰甲喹是我国于上世纪八十年代开发的用于治疗猪痢疾、鸡白痢等疾病的喹噁啉类动物专用药。虽然我国已经批准了乙酰甲喹的上市,但在使用过程中,有很多关于鸡、猪中毒的相关报道,鉴于其和喹噁啉类相同的母环结构,其药物原形或代谢物可能存在毒性,从而对食品安全造成隐患。另外,国内外没有制定乙酰甲喹的休药期、残留靶组织和残留标示物,这也给其临床上的合理用药和食品安全的残留检测带来难度。目前国内外对乙酰甲喹在动物体内的吸收、分布、排泄和代谢很少或未见相关报道。因此,本课题以乙酰甲喹为研究对象,采用放射性同位素标记技术和液相与离子阱飞行时间质谱(LC/MS-ITTOF)联用技术,研究[3H]乙酰甲喹及其代谢物在大鼠、鸡和猪体内的吸收、分布、排泄和代谢,确定乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内的排泄和分布情况,确定残留靶组织;分离鉴定体内的代谢物并对可食性组织中主要代谢物进行相对定量,确定它们的残留消除规律,阐明乙酰甲喹在动物体内的残留标示物和毒性代谢物。 氚标乙酰甲喹以氚标邻硝基苯胺为起始原料,经过氧化和Beirut缩合两步反应得到。首先,将30mg氚标邻硝基苯胺溶入180ml异丙醇中,在12mg氢氧化钠提供的碱性条件下加入500ml氯酸钠氧化,反应3小时后得到氚标苯并夫咱-1-氧化物;第二步,将上一步反应所得的20mg产物用300ml三乙胺溶解,加入1 OOml乙酰丙酮进行Beirut缩合反应,15小时后得到氚标乙酰甲喹。 用高效液相色谱对目标产物和乙酰甲喹对照品进行比较,测定其化学纯度,用高效液相色谱和液体闪烁仪联用技术测定其放化纯度,对目标产物称重后计算收率和比活度。结果表明,合成的氚标乙酰甲喹的收率在45%-55%之间,化学纯度≥98%,放化纯度≥99%,比活度为16.9Ci/g,其化学纯度和放化纯度均达到动物实验的要求。 大鼠、鸡(代谢组分5组,每组4只,排泄组6只)和猪(代谢组分5组,每组2头,排泄组4头)按10mg/kg b.w.(大鼠、鸡比活度110mCi/g,猪169mCi/g)单次灌胃给药,给药后排泄组每24h收集尿液、粪便,消化后经液闪仪测定放射活度,计算[3H]乙酰甲喹的排泄情况;各组动物分别在给药后6h、1d、2d、4d、6d和10d宰杀(猪为6h、1d、3d、6d、10d和15d),取体内的各个组织,消化后经液闪仪检测放射活度,测定药物在体内各组织中的分布情况;利用不同试剂对排泄物和可食性组织样品进行提取、净化,测定提取液放射活度计算提取率,然后进行HPLC/MS-IT-TOF进行代谢物分离鉴定;采用同样的提取净化后,经HPLC分析进行代谢物的相对定量。 结果显示,大鼠、鸡和猪给药后排泄物中的放射活度回收率0-0.5d分别为34.55%、39.9%和32.04%,0.5-1d为28.11%、31.25%和30.68%,1-3d为15.21%、11.06%和11.26%,3-6d为12.96%、6.59%和8.6%,6-10d为2.9%、5.87%和7.17%,猪10-15d为2.12%,总计分别为93.81%、94.67%和91.85%,其中大鼠和猪尿液中的放射活度回收率分别达到84.03%和83.5%;药物在组织中分布广泛,给药后6h大鼠、鸡和猪各个组织中的药物浓度分别在500μg/kg、800μg/kg和1400μg/kg以上,药物消除较快,2d(猪为3d)后各组织中的药物浓度分别下降到100μg/kg、100μg/kg和200μg/kg以下(肝脏、肾脏除外);大鼠给药后6d,鸡给药后4d,猪给药后10d,除肝脏、肾脏、胆汁外其他组织检测不到药物,最后一组动物宰杀后只在肝脏中检测到药物,乙酰甲喹的总残留在大鼠、鸡和猪各组织中残留时间最长的为肝脏,因此,确定肝脏为残留靶组织。排泄、分布结果表明,乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内吸收快,排泄快,分布广泛。 乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内分别发现11、12和8种代谢物,三种动物之间大部分代谢物相同,但存在差异,例如代谢物M11只在鸡体内检出,而代谢物M5只在猪体内发现。从代谢物的结构分析,乙酰甲喹在三种动物体内的代谢途径和代谢方式相同,主要发生脱氧、羰基还原和羟基化。大鼠、鸡和猪可食性组织中不同时间点体内的代谢物均以肝脏最多,分别为8种(M0、M1、M2、M3、M4、M8、M10和M14)、7种(M1、M2、M3、M4、M7、M8和M10)和7种(M1、M2、M3、M4、M5、M8和M10)。各个代谢物在大鼠、鸡和猪体内的消除速率存在差异,给药后4d大鼠肝脏中只有代谢物M2、M4和M10,鸡肝脏中只有代谢物M4,猪给药后6d肝脏中只有代谢物M2和M4。结果表明,乙酰甲喹在体内很快代谢,且生成的代谢物较多,主要代谢物可能存在种属差异。 对残留靶组织肝脏中主要代谢物进行峰面积的相对定量,然后用最后三个点的药物浓度和时间进行半对数线性回归,得到回归方程,计算总残留和主要代谢物的半衰期。结果显示,大鼠、鸡和猪肝脏中总残留的半衰期分别为1.39d、0.83d和1.62d,代谢物M4的半衰期分别为1.67d、0.84d和1.63d,代谢物M2的半衰期分别为0.98d、0.35d和1.54d。大鼠、鸡和猪肝脏中主要的代谢物M4的残留消除规律与总残留的消除规律存在一定的相关性,因此,乙酰甲喹的残留标示物可能为代谢物M4。 综上所述,本论文首次合成了放射性同位素标记的[3H]乙酰甲喹,研究了其相关的质量标准;阐明了乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内的吸收、分布和排泄特点;分离并鉴定了大鼠、鸡和猪体内的代谢产物,并对可食性组织中主要的代谢物进行了相对定量,从而确定了乙酰甲喹的残留靶组织和残留标示物。本文的研究结果为澄清乙酰甲喹代谢提供了比较全面的信息,为乙酰甲喹可能代谢部位确定和种属差异原因提供了重要的理论基础,对其毒副作用机制研究、体内残留分析方法建立和毒性化合物的研究确定具有十分重要的指导意义。……   
[关键词]:乙酞甲喹;吸收;分布;排泄;代谢;残留;LC/MS-IT-TOF
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年