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产聚半乳糖醛酸酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质的研究

胡慧磊

   我国对聚半乳糖醛酸酶的研究、生产、应用起步较晚,目前市售的聚半乳糖醛酸酶多以Aspergillus niger发酵生产,酶制剂的产量和质量均不能满足食品工业的需求,且价格较贵。本实验以腐烂水果、果园土壤、堆肥、生物肥料中分离出的120株菌株为出发菌株,经过一系列的筛选、鉴定、诱变选育,得到1株高产聚半乳糖醛酸酶的Aspergillus terreus突变株,并对其做了发酵产酶条件和酶学性质的研究。研究结果如下: 采用染色透明圈法初筛获得20株水解透明圈直径(Dp)与菌落直径(Dc)比值较大的菌株。再通过液体发酵,测定粗酶液酶活力,复筛出5株编号为C1、C2、C3、G1、H4的高产聚半乳糖醛酸酶菌株,其酶活力分别达到17.89U/mL、17.68U/mL、18.37U/mL、14.04U/mL,13.56U/mL。最后经过菌落形态,显微形态和生理生化特征的鉴定,结果为C1、C2、C3-土曲霉(Aspergillus terreus);G1-互隔交链孢霉(Alternaria alternate);H4-黑曲霉(Aspergillus niger)。 Aspergillus terreus C3分别经紫外线(UV)、微波处理后,发现最佳照射时间分别为360s和50s,在此照射条件下,致死率分别达到86.89%和83.05%,正突变率为33.33%和20%。UV诱变筛选到突变菌株C3-A8,其酶活力提高了12.79%,且传代稳定性较好。微波诱变筛选到突变菌株C3-B5,其酶活力提高了11.27%,但传代稳定性较差。突变株C3-A8和C3-B5分别以不同浓度的LiCl处理不同的时间后,发现5%LiCl处理5min为最佳条件,致死率分别为33.90%和32.14%,正突变率为8.33%和9.09%。UV-LiCl复合诱变筛选到突变菌株C3-A8-B6,其酶活力达到21U/mL,比原始菌株C3提高了14.32%,且传代稳定性较好。微波-LiCl复合诱变筛选到突变菌株C3-B5-D5,其酶活力为20.88U/mL,比原始菌株C3提高了13.66%,但传代稳定性效果不理想。 以筛选出的Aspergillus terreus突变株C3-A8-B6为研究菌株,通过单因素和正交实验确定了最佳的培养基组分和发酵培养条件。已优化的培养基组分为:豆饼粉5%,桔皮粉5%,NaNO2 0.6%, MgSO47H2O 0.5mmoL/L, MnSO4H2O 0.75mmoL/L, K2HPO40.1%, CaCl2 0.75mmoL/L, BaCl2 1mmoL/L, FeSO47H2O 0.5mmoL/L。最适产酶的培养条件为:培养温度30℃,初始pH5.0,装液量为250mL三角瓶装入45mL液体培养基,摇床转速为190r/min,接种量为106个/mL孢子悬液7%(V/V),培养时间为4d。在此培养基和发酵条件下,菌株产酶活力可达44.642U/mL,较优化前有明显的提高。 粗酶液经过2次超滤浓缩,SephadexG-100凝胶柱层析,对该酶进行了分离纯化,SDS-PAGE电泳检验了其纯度,且确定了该酶的分子量为39.87KDa。该酶的最适作用温度为38℃,在38-53℃范围内,酶活力稳定,保温1h后,酶活力均保留在90%以上。该酶的最适作用pH为5.0~6.0之间,在pH4.5~6.0之间,酶活力可保持90%以上。金属离子Fe2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+对酶活力有显著的激活作用,Cu2+,Al3+对酶活力有较强的抑制作用。Na+、K+对酶活力的激活作用和Li+、Zn2+、Si2+对酶活力的抑制作用均不显著。该酶的米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为9.24×10-3g/L和1.027×103μg/min。……   
[关键词]:土曲霉;聚半乳糖醛酸酶;鉴定;诱变;发酵;酶学性质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年