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实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

王忠发;王建跃;卢亦愚;何伟贤;王学海

  目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的 PCR 方法用于对虾皮下造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据 GenBank 登录的 IHHNV 毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在 IHHNV 保守区序列设计特异性引物与 Taqman 探针。对实时荧光定量 PCR 反应条件进行优化以缩短检测时间、提高特异性、灵敏度、重复性、并与普通 PCR 进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×10~2~5×10~4拷贝/ml,检出限5×10~1拷贝/ml,灵敏度超过普通 PCR100 倍,特异性高于普通 PCR,重复性极好(S=0.035~0.39 CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通 PCR 的1/5,现场盲样 IHHNV 检出阳性率高于普通 PCR26.00%。结论:本研究建立 Taqman 实时荧光定量 PCR 用于对虾 IHHNV 检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。……