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基于血清外泌体和肝脏miRNA表达谱的川楝子致小鼠肝毒性机制研究

俞铃琪;郑洁;李俊颖;陆晓燕;范骁辉

  目的:在中国,中草药已成为药物性肝损伤最主要的致病因素,占比达28.4%。但是,迄今为止对于中草药引起肝损伤的机制认识仍十分匮乏,严重影响了中草药的临床应用。由于外泌体和肝脏中的mi RNA在肝脏疾病中起着重要作用,因此本文以小毒中药川楝子诱导的肝损伤为研究对象,通过整合分析川楝子致肝毒性小鼠的血清外泌体和肝脏miRNA表达谱,揭示川楝子致肝毒性的机制,寻找发现潜在的毒性生物标志物。材料和方法:小鼠灌胃给予20 g/kg和40 g/kg两种剂量的川楝子乙酸乙酯萃取物,药物作用9天后,提取血清外泌体中的RNA,采用高通量表达谱芯片系统分析川楝子给药后小鼠血清外泌体中miRNA的表达谱,进一步结合肝脏miRNA表达谱数据,基于生物信息学的技术分析川楝子致小鼠肝损伤所涉及的生物通路;对于显著富集的生物通路,采用TUNEL染色和WesternBlot等方法进行验证,进一步阐明川楝子致小鼠肝毒性的机制。此外,采用体外肝细胞模型及自噬流抑制剂,初步明确自噬在川楝子引起的小鼠肝损伤中的作用。结果:常规毒理学结果显示,与对照组相比,高剂量(40 g/kg)川楝子乙酸乙酯萃取物给药9天能引起小鼠发生明显的肝损伤。进一步的血清外泌体miRNA表达谱分析发现,与对照组相比,有209个miRNA在高剂量川楝子给药组中差异表达。对差异miRNA对应的靶基因进行通路富集分析显示,川楝子致肝毒性的机制可能与抑制PI3K/Akt,激活p53、PTEN等与凋亡相关的信号通路有关。整合分析血清外泌体和肝脏miRNA表达谱的数据表明,自噬可能在川楝子引起的小鼠肝损伤中起重要作用。体内验证实验结果发现,高剂量川楝子暴露后,能引起肝组织中PTEN、p-AKT、p53和BAX蛋白表达水平的变化及小鼠肝细胞凋亡,表明川楝子引起的小鼠肝损伤与上述信号通路变化引起的肝细胞凋亡相关。而体外验证实验表明自噬在川楝子引起的小鼠肝损伤中起保护作用。此外,血清外泌体miR-222是高、低剂量川楝子给药后均显著下调且表达变化最明显的miRNA,提示miR-222可能是川楝子致肝毒性的潜在毒性生物标志物。结论:整合分析血清外泌体和肝脏miRNA表达谱能深入认识小毒中药川楝子致肝毒性的内在机制,发现潜在的毒性生物标志物。该方法同样适用于其他中草药靶器官毒性的机制研究。……