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口蹄疫病毒双效疫苗载体的构建及其体外表达研究

杨彬;兰喜;殷相平;李学瑞;李宝玉;方玉萍;柳纪省

  用RT-PCR法获得了针对口蹄疫病毒(FMDV)基因组5 非编码区内包含病毒复制起始元件的基因片段ASCN及其结构蛋白VP1基因,将其分别克隆至双顺反子表达载体pIRES中,构建成了双表达质粒pASCN-IR-VP1,经酶切、PCR及DNA测序分析表明ASCN及VP1基因已正确地插入到pIRES中,编码序列及插入方向均正确。用脂质体介导法将双效表达质粒导入BHK-21细胞后,经RT-PCR、实时荧光定量PCR检测表明双效表达质粒中的ASCN在细胞中得到了有效转录,mRNA的表达量达到了1.27×10~6个拷贝/μL;经夹心ELISA及间接免疫荧光标记等试验表明VP1结构蛋白基因在BHK-21细胞中得到了表达,具有良好的生物学活性。双效质粒pASCN-IR-VP1转染IBRS-2细胞24h后,按100TCID_(50)/0.1mL的量接FMDV OMⅢ毒,结果该质粒能够明显地抑制FMDV的复制,使病变时间推迟约16~18h,接毒48h时的抑制率达到60%以上,蚀斑减少试验也证实了该双效质粒的病毒抑制作用。研究结果表明成功构建了FMDV双效表达载体,为进一步研究双效疫苗免疫效力提供了前期基础。……