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多重聚合酶链反应快速检测嗜水气单胞菌和爱德华菌

邓显文;谢芝勋;谢志勤;刘加波;庞耀珊;谢丽基

  嗜水气单胞菌是一种典型的人—兽-鱼共患病病原,嗜水气单胞菌、爱德华氏菌的病原分离鉴定、血清学检测方法等,都无法快速鉴别嗜水气单胞菌、爱德华氏菌,不能适应规模化养殖的需要,因此应用特异、快速、敏感的聚合酶链反应式(PCR)检测嗜水气单胞菌、爱德华菌技术就显得非常重要。本研究根据嗜水气单胞菌株和爱德华菌株16S rDNA基因的结构特点,设计合成了二对引物XZAH3、XZAH4和XZE7b、XZE8。以嗜水气单胞菌株和爱得华氏菌株培养物抽提的DNA为模板,对PCR各循环参数和各引物浓度等进行优化,以确定最佳的PCR反应条件;将已提取的嗜水气单胞菌株和爱德华菌株的DNA以及其它鱼类病原菌(毒)株的DNA分别加入到所建立的多重PCR反应体系中进行扩增,检测其特异性;测定嗜水气单胞菌株和爱德华菌株模板的DNA含量后,按10倍递增稀释,同时加入到最佳的多重PCR反应体系中进行扩增,检测其敏感性。试验最后确定多重PCR中二对引物的最佳工作浓度是XZAH3、XZAH4为500ng和XZE7b、XZE8为1500ng;多重PCR的最佳反应模式为94℃变性5min,然后进入94℃变性1min,54℃退火1min,72℃延伸1min的循环,共进行35个循环,最后再经72℃延伸10min后,于4℃结束反应;应用该程序对嗜水气单胞菌株、爱德华菌株核酸和其它鱼类病原菌毒株核酸分别进行多重PCR扩增,结果嗜水气单胞菌株只扩增出361bp一条带,而爱德华菌株只扩增出576bp一条带,而对其它鱼类病原菌核酸的PCR扩增,均未出现任何扩增条带;经过敏感性测定,多重PCR最低能检出10pg嗜水气单胞菌株、爱德华菌株DNA模板。……   
[关键词]:多重PCR;检测;嗜水气单胞菌;爱德华菌
[文献类型]:会议论文
[文献出处]: 《第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集2008年