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体外微核高内涵筛选方法的建立及应用研究

林海霞;周飞;常艳

  目的体外微核高内涵筛选(HCS)方法是人工体外微核试验的改良方法之一,主要是借助仪器通过软件对试验结果进行判定,与人工微核试验相比具有省时、省力、成本低廉、对化学物质用量需求少、评价信息丰富等优点,适用于大量化学物质的筛选。本研究采用HCS方法对5种常用阳性物进行微核检测,从而建立HCS方法,并应用该方法对3种待测物质进行微核分析。方法将处于对数生长期的CHO细胞调整细胞密度至2.5~3.0×10~4个/mL接种于96孔板中,每孔加入100μL细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)。将96孔板放置细胞培养箱中,37℃、5%CO_2连续培养18~24小时。培养结束后向96孔板的每孔中加入75μL细胞染液进行孵育。孵育结束后,吸除细胞染液,每孔加入1μL的受试物(分别为苯并芘、甲基磺酸乙酯EMS、甲基磺酸甲酯MMS、2-氨基芴、2-硝基蒽、依托泊苷、秋水仙碱、氯化铬)和/或溶剂,处理3或20小时后去除受试物和/或溶剂,用无血清培养基清洗2次,再加入100μL细胞松弛素处理28小时。最后用Hoechst染液染色20分钟,去除染液进行洗板后在Cellomics ArrayScan上进行检测。采用卡方检验,对微核率进行统计分析。结果试验结果显示:在非代谢活化条件下,与各自阴性对照组相比,苯并比在终浓度≥12.58μg/mL时诱发的微核率开始增加,在终浓度为25.15和50.3μg/mL时微核率显著增加(p<0.01);EMS在0.754~3.018 mg/mL微核率显著性增加(p<0.01);MMS在0.025~0.101mg/mL微核率显著增加(p<0.05或p<0.01)。在代谢活化条件下,2-氨基芴在终浓度>0.4μg/mL时微核发生率显著增加(p<0.05);2-硝基蒽在终浓度为6.44~51.5μg/mL微核率显著增加(p<0.05或p<0.01)。依托泊苷在终浓度为0.08~1.25μg/mL微核率显著增加(p<0.05或p<0.01);秋水仙碱在0.02~0.319μg/mL微核率显著增加(p<0.05或p<0.01);氯化铬在终浓度为2.344μg/mL时,微核率显著性增加(p<0.01)。结论目前哺乳动物细胞体外微核试验是评价新化合物遗传毒性的重要试验之一。在本试验条件下,5种常用的评价遗传毒性阳性物质(苯并比、EMS、MMS、2-氨基芴及2-硝基蒽)在HCS试验统中均呈现阳性结果,提示本试验方法成立;3种待测物质(依托泊苷、秋水仙碱及氯化铬)出现阳性结果,与已知文献报道一致。由于本次试验选取待测物质数量有限,目前尚无法对HCS试验的评价效能进行判定,但是参照目前已获得的试验结果可以看出,体外微核高内涵筛选方法的评价结果可信。体外微核高内涵筛选方法能实现对大量化学物质进行快速有效的筛选,具有良好的应用前景。……