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脂筏在tmTNF-a反向信号传递中的作用

陈克清;刘涛;于敏;尹丙姣;王晶;李卓娅

  脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。本室前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有报道tmTNF-α-47位是棕榈酰化位点,而酰基化是膜蛋白分子定位在脂筏内的必要条件之一,故推测tmTNF-α可能定位在脂筏中,研究脂筏定位与tmTNF-α反向信号的关系。用蔗糖密度梯度离心法提取脂筏结构,利用tmTNF-α特异性抗体进行Western blot,明确tmTNF-α的脂筏定位。用胆固醇破坏剂甲基环糊精(MCD)破坏细胞的脂筏结构,MTT法观察sTNF-α的杀伤效应。采用重叠PCR对tmTNF-α的-47位进行定点突变,构建去棕榈酰化突变体C-47A tmTNF-α-pIRES2-EGFP。Western blot检测定位在脂筏内外的tmTNF-稳转细胞株NF-B相关信号通路。用丝氨酸蛋白激酶抑制剂(D4476)抑制脂筏内外tmTNF-α磷酸化,观察反向信号增强情况。Real time PCR检测凋亡相关基因的表达。用sTNFR2刺激Raji细胞以激活反向信号,观察相关信号分子在脂筏内外分布的变化。①tmTNF-α部分分布在脂筏内,MCD处理后,脂筏内分子转移至脂筏外,C-47A tmTNF-α则完全分布在脂筏外。②细胞脂筏破坏后,增加了对sTNF-α胞毒的敏感性。为排除MCD的非特异性,sTNF-α对稳转细胞株的杀伤同样存在差异,对C-47A tmTNF-α细胞株约有50%的杀伤效率,而对tmTNF-α细胞株的杀伤则明显下降(p<0.01)。③只有脂筏内的tmTNF-α才出现IκB-α降解,p65磷酸化水平升高,提示NF-κB活化。④抑制tmTNF-α胞内段发生磷酸化后增强tmTNF-α细胞株的反向信号(p<0.05),却对C-47A tmTNF-α细胞株无明显作用(p>0.05)。tmTNF-α细胞株可以诱导抗凋亡基因cIAP-1的表达,却明显抑制促凋亡基因Bax的转录,C-47A tmTNF-α细胞株却对这两个基因转录无明显影响。⑤与非刺激水平相比,sTNFR2刺激能引起tmTNF-α、TRAF1、IKK-α和p52向脂筏内聚集,提示tmTNF-α可能是以脂筏为平台传递反向信号的。本研究证明脂筏参与tmTNF-α反向信号转导,只有脂筏内的tmTNF-α才能激活NF-κB,诱导tmTNF-α表达细胞对sTNF-α发生耐受,为阐明脂筏在tmTNF-α发挥生物学功能中的作用提供了新的线索和实验依据。……