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猪瘟病毒E~(rns)和E2基因的高效表达与E~(rns)-ELISA鉴别诊断方法的建立

贾洪林;仇华吉;李国新;朱庆虎;李娜;童光志

  猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度传染性和致死性疾病。为建立与以猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2为基础的标记疫苗相配套的鉴别诊断试验,本研究克隆了猪瘟病毒石门系强毒株Erns基因和E2基因主要抗原编码区,同时分别将其在大肠杆菌中进行了高效表达,并建立了基于重组蛋白抗原的Erns-ELISA和E2-ELISA诊断方法。设计并合成跨越CSFV Erns基因和E2基因主要抗原编码区序列的特异性引物,采用RT-PCR方法从CSFV石门系强毒株基因组RNA中扩增出0.7kb的完整Erns基因片段,从含有E2基因的重组质粒pcCDST中扩增出0.4kb的部分E2基因片段,分别将其克隆于原核表达载体pPROEXTMHTc和pPROEXTMHTb中,经酶切和PCR鉴定后,再进行序列测定。结果表明,Erns基因编码区核苷酸序列长度为723bp,编码240个氨基酸残基;部分E2基因片段的核苷酸序列长384bp,编码128个氨基酸残基,分别与GenBank中收录的CSFV石门系强毒株(GenBank accession No.AF092448)对应序列一致。阳性菌经IPTG诱导后获得高效表达,表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,表达的重组Erns融合蛋白和截短的重组E2融合蛋白分子量分别为31ku和19ku左右,分别占菌体总蛋白的27.6%和33.5%。Western blotting分析表明,表达的融合蛋白均具有免疫反应性。将表达的融合蛋白分别进行亲和层析纯化,得到纯度很高的目的蛋白。用纯化的Erns融合蛋白作为包被抗原建立了Erns-ELISA,经优化,抗原最适包被量为0.15μg,血清工作浓度为1:100倍稀释,阳性判定标准为OD490(?)0.3。经敏感性试验、特异性试验、阻断试验和重复性试验表明,本研究建立的Erns-ELISA简便、敏感、特异、稳定。通过对90份血清进行平行盲测,Erns-ELISA与E2-ELISA的符合率高达96.7%,与基于病毒抗原的Dot-ELISA的符合率达77.5%。总之,本研究高效表达了猪瘟病毒Erns与部分E2基因,建立了Erns-ELISA和E2-ELISA,可以作为基于E2蛋白的猪瘟标记疫苗的配套鉴别诊断技术,用于今后的猪瘟扑灭计划。……