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人结核杆菌HSP65重组BCG疫苗的构建、表达及鉴定

高红;戴五星;黄海浪;陈智浩;梁靓;皇甫永穆

  在结核杆菌感染中,热休克蛋白65(HSP65)是最重要的免疫保护性抗原之一。用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCG-SP-HSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明所克隆的两个DNA片段与报道结果完全一致,重组体连接方向正确,阅读框准确无误。利用电穿孔将该质粒转入BCG中,构建成功重组BCG疫苗。热诱导后用SDS-PAGE观察到重组BCG表达的65Ku蛋白占菌体总蛋白的35.67%,占裂解物上清总蛋白的74.09%,表明重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Western-blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。……